Главная


Спирт ферейн - этиловый спирт.

Оборудование для иммунофлюоресцентного анализа

При возбуждении светом определенных длин волн флюорохромы начинают флюоресцировать. Кванты флюоресцентного излучения обладают меньшей энергией, чем кванты возбуждающего излучения, это означает, что флюоресцентное излучение имеет большую длину волны, чем возбуждающее (правило Стокса). Необходимо добиваться четкого разделения возбуждающего и флюоресцентного излучения. Этого можно достичь использованием фильтров и подбором длин волн возбуждающего излучения.

Микроскоп. Иммунофлюоресценцию исследуют при помощи специальных микроскопов, включающих такие детали, как специальные источники света, фильтры, УФ-оптика и др. Нет смысла рекомендовать для работы какой-нибудь один тип микроскопа, подходит любой вариант, обеспечивающий необходимые условия. Для работы с ФИТЦ рекомендуется узкополосное голубое освещение, для ТРИТЦ — зеленое. В качестве источников света, как правило, используют ртутные лампы высокого давления (линейчатый спектр излучения). Возбуждающее излучение голубого и зеленого цвета получают пропусканием света таких ламп через светосильный интерференционный фильтр. Можно использовать галогеновые лампы на 12 В (50 илн 100 Вт), они более удобны в обращении, быстрее нагреваются, дешевле при одинаковой с ртутными лампами интенсивности излучения. Фильтры необходимы для того, чтобы пропускать из спектра лампы только тот участок, который необходим для возбуждения флюорохрома (первичный фильтр, или фильтр возбуждения), а также задерживать возбуждающее излучение и пропускать только излучение флюоресценции (вторичный или запирающий фильтр).

Ход лучей в флюоресцентном микроскопе на примере Fluoval 2 VEB Carl Zeiss

1 — источник света; 2 — первичный фильтр; 3 — дихроматическое разделяющее зеркало;
4 — объектив; 5 — запирающий фильтр; 6 — окуляр; 7 — проекторное устройство.

 Кривые пропускания света важнейших типов фильтров, применяемых в флюоресцентной микроскопии

Классификация важнейших типов фильтров, применяемых для флюоресцентной микроскопии

Обозначение фильтра А
КР 490
в
КР 560
с
BG 12
D
BG 23
Е
GG 5
F
OG 4
Тип фильтра Металлический интерференционный Стеклянный адсорбционный Стеклянный пропускающий
Характеристика фильтра Узкополосный   Широкополосный
Функция фильтра
на примере голубого
возбуждающего
излучения


 

Первичный
фильтр

 

Первичный
или вторичный
вспомогательный
фильтр,
суживающий
или отсекающий
красный свет
Первичный
фильтр

 

Первичный
вспомогательный
фильтр,
отсекающий
красный свет

Первичный
вспомогательный
фильтр
суживающий

  
Вторичный
фильтр

 

Проницаемость фильтров или их комбинаций для изучения может быть низко- или широкополосной, в качестве границы между этими градациями принята полоса излучения шириной 50 нм. Сужение полосы спектра возбуждения или флюоресценции оправдано только в случае применения фильтров с четким «окном» пропускания и высокой прозрачностью, но и в этих случаях наблюдается снижение интенсивности. Более удобным оказывается узкополосное возбуждение, получаемое за счет поглощения или блокирования аутофлюоресценции, которая возбуждается излучением близкого УФ или фиолетового цвета.

Несмотря на снижение интенсивности флюоресценции, в этих случаях контрастность изображения и, следовательно, разрешающая способность увеличиваются. Оптика, как правило, должна быть светосильной, т. е. обладать широкой апертурой, поскольку интенсивность изображения пропорциональна квадрату апертуры. Оптимальным можно считать увеличение объекта, равное 20—100, поскольку в этом случае объектив может служить для освещения объекта. Сила объектива при этом удваивается для флюоресцентного излучения. Поэтому стараются использовать объективы с максимальной апертурой, причем не обязательно апохроматические. Увеличивающая оптика второй ступени (окуляры, проекционная оптика) должна, напротив, обладать минимальным увеличением для получения изображения максимальной освещенности.

Иногда представляет большой интерес помещение флюоресцирующих объектов в нефлюоресцирующую ткань и микроскопия в других условиях освещения или в фазовом контрасте. Особенно выгодные возможности для этого предоставляет люминесцентная микроскопия. Комбинация флюоресценции с микроскопией в светлых или темных полях зрения только в редких случаях дает удовлетворительные результаты. Лучшие результаты дает применение фазово-контрастной микроскопии со специальными объективами, пригодными также и для иммунофлюоресцентного анализа.

Хорошее контрастирование (слабый эффект Гало) весьма выгодно при рассматривании мелких объектов (микроорганизмы, отдельные клетки), но не дает существенных преимуществ при микроскопии срезов тканей. В работе с такими объектами (большая площадь) лучше использовать интерференционное контрастирование. В любом случае контраст зависит от разности коэффициентов преломления объекта и среды, в которую он заключен. Изменением среды (например, увеличением пропорции глицерина) можно добиться изменения контрастности. При комбинации флюоресцентного анализа с оптической поляризацией следует помнить, что дихроматический разделяющий слой зеркала сам по себе обладает способностью поляризировать свет.