Главная


Купить справку смотрите на www.купить-справки.рф.
бильярдный стол чемпион
Где купить простое свадебное платье.

Методы, основанные на применении меченых антител

Меченые радиоактивными изотопами антитела представляют собой универсальные реагенты для определения различных антигенов (вирусы, гормоны и т. д.). Существенным отличием от обычного радиоиммунологического анализа является то, что меченый компонент должен содержаться в избытке. После окончания реакции в одном из вариантов иммунорадиометрического анализа избыток меченых антител удаляют антигены, адсорбированным на твердой фазе. В случае использования так называемого сэндвич-метода необходима длительная отмывка после первого этапа использования твердой фазы. На рисунках схематически представлены основные этапы анализа.

Принцип иммунор адиометрического анализа

Принцип иммунор адиометрического анализа

Схема «сэндвич-метода»

Схема «сэндвич-метода»

Степень связывания в иммунорадиометрическом анализе определяется путем измерения радиоактивности надосадочной фракции после центрифугирования. В процессе оптимизации анализа определяющими факторами являются неспецифическое связывание, продолжительность инкубации и концентрация меченых антител. Неспецифическое связывание можно уменьшить, работая с высокоочищенными антителами, кроме того, оно зависит от ионной силы; его уменьшения можно добиться добавлением желатина или сывороточного альбумина. Использование избытка меченых антител позволяет сократить время инкубации; правда, это приводит к снижению чувствительности.

Применяемые для «сэндвич-метода» антител должны относиться только к классу IgG; их довольно легко получать, и, кроме того, они пригодны для работы с самыми различными антигенами. Применяя антител со специфичностью к Н-цепям иммуноглобулинов, можно установить класс первично связывающих антител. Использование меченых антител представляется приемлемой альтернативой в тех случаях, когда получение меченого антигена является неэффективным или дорогостоящим процессом. Меченые 125 I антител получаются сравнительно легко, кроме того, они сохраняют специфическую иммунореактивность в течение длительного времени. Методы, основанные на применении меченых антител, давно уже вошли в практику многих лабораторий. Количественное определение антител затруднено ввиду их различной авидности, для проведения стандартизации необходимо применение референс-сывороток.

Применяя антитела, модифицированные 2,4-динитрофенилсульфоновой кислотой, можно количественно определять различные антигены, если имеются меченые 125[I] анти-ДНФ антитела; одновременно с этим наблюдается повышение чувствительности. Этот вариант анализа с успехом применяли для определения ферритина, овальбумина, gs-антигена аденовирусов и НВе-антигена.

Иммунорадиометрическое определение при помощи антител, специфических к ДНФ-группе. IgG очищают при помощи хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе из соответствующих АС. В концентрации 100 мкг/мл в 0,1 М трис-HCl-буфере с рН 8,8 IgG используют для обработки пластиковых гранул диаметром 8 мм. Такой препарат IgG используют для получения 2,4-динит-рофенильного производного. Анти-ДНФ антитела получают иммунизацией кроликов ДНФ-БСА. Специфические антитела выделяют, добавляя 10 мг ДНФ-апоферритина к 2 мл антисыворотки, что вызывает иммунопреципитацию. Иммунные комплексы осаждают центрифугированием при 90 ООО g в течение 1 часа, осадок в 1 мл фосфатного буфера с мочевиной (0,01 М фосфат с рН 8,0; 0,1% нонидет Р40; 8 М мочевина). После хроматографии на колонке с 2 мл ДЭАЭ-целлюлозы фракция, содержащая IgG, диализуется против 0,05 М боратного буфера с рН 8,5 и метится реагентом Bolton-Hunter (специфическая радиоактивность 125[I] 1,2 мкКи/мкг). Адсорбция антигена на пластиковых гранулах происходит в течение ночи при 20°С в 400 мкл нормальной сыворотки. Гранулы отмывают буфером (0,01 М трис-HCl буфером с рН 8,0, 0,14 М NaCl, 0,1% нонидет Р40). В каждую пробиркув носят 0,6—2,5 мкг антигенспецифических ДНФ-АТ и инкубируют 2 часа при 37°С. Затем вносят 0,1 мкКи 125[I]-АТ, специфических к ДНФ группам, также растворенным в 400 мкл нормальной сыворотки. После инкубации в течение 2 часов при 37°С и повторной отмывки тем же буфером измеряют количество специфических 125[I]-антител.

Чувствительность определения овальбумина и ферритина составляет соответственно 0,8 и 0,2 нг/мл; сравнительно с прямым твердофазным анализом с применением 125[I]-антител чувствительность определения увеличивается в 4 или 15 раз соответственно.

Стандартная кривая для определения ферритнна (1) и овальбумнна (2)

Стандартная кривая для определения ферритнна (1) и овальбумнна (2)

Чувствительность за счет эффекта амплификации при использовании анти-ДНФ-антител увеличивается также и в отношении НВе-антигена.

Стандартная кривая для определения НВе-антигена

Стандартная кривая для определения НВе-антигена

1 — непрямой «сэндвич-метод»; 2 — прямой «сэндвич-метод»

Известен метод твердофазного анализа, основанный на применении 125[I]-протеина А для определения специфических антител. Хотя этот метод основан на избирательном сродстве протеина А к Fc-фрагменту IgG, фиксация антигенов на матрице должна осуществляться без участия антител.