Главная


На http://montale-original.ru montale velvet flowers.
Смотрите http://www.sillage-original.ru house Of Sillage Holiday.

Реакция связывания комплемента тромбоцитами. Методика

Материалы и оборудование. Для работы необходимы: 0,9% раствор NaCl; 5% раствор ЭДТА в 0,15 М NaCl, 0,1% раствор азида натрия в 0,15 М NaCl, барбиталовый буфер, гемолизин (гемолитическая сыворотка) к бараньим эритроцитам, комплемент, тромбоциты, исследуемая сыворотка, вазелиновое масло, камеры для микрокультивирования № 3034 (Falcon, Швейцария), гамильтоновские микрошприцы 705N и 710N, микродозатор РВ 600-1 (Hamilton, Нидерланды), термостат на 37°С, водяные бани на 37°С и 56°С, центрифуги, холодильник, вибрационный смеситель, центрифужные пробирки, пробирки для титрования, мерные пипетки. Для постоянной работы требуется большой запас посуды и материалов. Вся стеклянная посуда должна быть идеально чистой и свободной от бактериального загрязнения. Посуду рекомендуется мыть хромовой смесью.

Барбиталовый буфер, рН 7,4 (исходный раствор):

Барбитал — 5,75 г
Барбитал-натрий — 3,75 г
NaCl —85,0 г
1 № MgCl2 — 5,0 мл
1 М СаСl2— 1,5 мл
Бидистиллированная вода до 2000,0 мл

Исходный раствор автоклавируют, перед употреблением разводят в 5 раз дистиллированной водой.

Гемолизин, готовят стабилизированный раствор гемолитической АС 1 : 100. Он сохраняет стабильность в течение нескольких недель:

0,9% раствор NaCl —94,0 мл
0,5% фенол в 0,9% NaCl —4,0
Гемолитическая АС— 1,0
Глицерин — 1,0

Перед употреблением гемолизин выдерживают 3—4 дня.

Эритроциты барана: эритроциты барана стерильно отбирают в гемостабилизатор и перед использованием выдерживают около 6 дней при 4°С.

Комплемент: сыворотки АВ, свежая пуловая сыворотка, проверенная на активность комплемента (минимальный титр 1:25). АВ-сыворотку здоровых, не получавших гемотрансфузий доноров мужского пола, хранят небольшими порциями в жидком азоте или при —80 °С. В жидком азоте комплемент сохраняет стабильность в течение нескольких месяцев.

Комплемент морской свинки: смешивают сыворотки животных с титром комплемента не менее 1:60, немедленно замораживают небольшими порциями или лиофилизируют. Ввиду высоких титров комплемента сыворотку морских свинок можно хранить несколько дней при —20 °С. Реакция связывания комплемента более чувствительна, если в качестве источника комплемента используется сыворотка АВ.

Суспепзия тромбоцитов: 10—60 мл крови собирают в отношении 1+9 в 5% раствор Na2-ЭДТА, выдерживают смесь 60 минут при комнатной температуре для оседания эритроцитов. Центрифугируют 10 минут при 200 g и сливают около 4/5 надосадочной фракции (плазма, обогащенная эритроцитами). Если присутствует примесь эритроцитов, плазму центрифугируют еще раз 10 минут при 200 g. Надосадочиую фракцию, содержащую только тромбоциты, центрифугируют 15 минут при 1600 g. Осадок тромбоцитов трижды отмывают 0,9% NaCl с 0,1% азидом натрия, доводят концентрацию суспензии до 2х106 клеток/мкл, сохраняют при 4°С. При соблюдении стерильных условий изготовления суспензия сохраняет пригодность в течение 12 месяцев. Для работы используют суспензию 0,5х106 клеток/мкг. Свежеприготовленная суспензия тромбоцитов связывает меньше комплемента, чем суспензия, «созревшая» за 24 часа. Суспензию тромбоцитов из крови, взятой в оксалат аммония, можно использовать тотчас же после приготовления.

Сыворотки: для выявления антигенов HLA на тромбоцитах и других «летках используют сыворотки беременных, пациентов, перенесших гемотрансфузию или трансплантацию, а также сыворотки специально иммунизированных доноров. Сыворотки получают по возможности стерильно и хранят их при — 20°С или в жидком азоте. Желательно избегать многократных замораживаний и оттаиваний. Обычно полученные сыворотки полиспецифичны, но с помощью адсорбции и элюции можно получить сыворотки, приближающиеся к моноспецифическим. Все сыворотки инактивируют нагреванием при 56°С в течение 30 минут. Сыворотки разводят барбиталовым буфером, если разведение более 1 : 10, к вероналовому буферу добавляют 10% инактивированной сыворотки АВ.