Главная


Смотрите описание этанол купить тут.

Селекция гибридных клеток на среде ГАТ

Слившиеся клетки аккуратно ресуспендируют в 40 мл среды ГАТ. К этой суспензии для поддержания роста добавляют 1х107 свежевыделенных ядерных клеток селезенки (см. раздел "Получение антителообразующих лимфоцитов"). Можно также применять перитонеальные макрофаги, получаемые смывом раствора глюкозы. Как показывают наши наблюдения, нет необходимости облучать поддерживающие клетки дозой в 2 Дж/кг (200 рад), хотя некоторые авторы это рекомендуют. Из суспензии клеток отбирают 192 пробы по 200 мкл и вносят их в плоскодонные планшеты для микрокультуральных работ. Культуры клеток инкубируют в водонасыщенной атмосфере, содержащей 5% СО2 при 37 °С. Начиная с 4-го дня после слияния, производят замену половины надосадочной фракции в лунках с культурой свежей порцией среды ГАТ; замену повторяют каждые 3 или 4 дня. Для этого половину надосадочной фракции клеточной культуры аккуратно отсасывают стерильными пастеровскими пипетками, соединенными с водоструйным насосом.

Под действием гипоксантин, аминоптерин и тимидин (ГАТ) дефектные по ГГФРТ плазмоцитомные клетки отмирают. Остаются неслившиеся клетки селезенки и гибридомы, образовавшиеся из клеток плазмоцитомы и ГГФРТ-положительных лимфоцитов. Скорость деления клеток селезенки невелика, в то время как скорость деления гибридных клеток примерно такая же, как у клеток плазмоцитомы, поэтому быстрорастущие клоны гибридом становятся различимы в виде плотных колоний клеток.

Рекомендуется как можно раньше заносить в протокол количество растущих гибридных клонов, поскольку позднее это становится затруднительным из-за слияния отдельных клонов и образования дочерних колоний. Подсчет количества клонов гибридных клеток лучше всего производить при помощи инвертированного микроскопа Televal на 6-й день, а затем незадолго до проверки антителообразующей способности (с 15-го до 18-й день). В обычных условиях частота слияний составляет 10-5 (образуется 1 гибридная клетка на 105 исходных клеток плазмоцитомы), что соответствует образованию 1 гибридного клона в 1 культуральной лунке. При оптимальных условиях достигается частота слияний, равная 10-4.