Главная


нейродоз

Реакция бласттрансформации лимфоцитов. Методика

Материалы и оборудование. Для работы нужно иметь стерильное рабочее место, оснащенное УФ-лампой, стерильные силиконизированные закрывающиеся сосуды. Возможны 2 варианта культивирования.

Оснащение для двух различных вариантов реакции бласттрансформации лимфоцитов

Оснащение для двух различных вариантов РБТЛ

Необходимы также ФГА (Wellcome, Великобритания), причем следует избегать замораживания и оттаивания, КонА (Pharmacia, Швеция), митоген лаконоса (PWM) (Grand Island Biol, corp, США), специфические антигены (в зависимости от целей исследования), 3 [Н]-тимидин-Сб (1 ТБк/мМ) (Чешский институт по исследованию, получению и применению изотопов); 0,15М NaCl, ТХУ 5%, метанол; РРО, РОРОР (New Engl. Nuclear, США), раствор Тюрка, тридистиллированная вода, раствор сцинтилятора (0,1—0,2 г РОРОР, 5,0 г РРО, толуол до 1000 мл). рН среды перед точной установкой объема подводят 1М NaOH до 7,4 (37°С).

Среда для реакции бласттрансформации лимфоцитов

Среда для РБТЛ

Рекомендуется иметь смесь антибиотиков, расфасованную на небольшие порции и хранящуюся в замороженном состоянии. Если используется СО2-инкубатор, к среде не добавляют ГЭПЭС. Нужно иметь также гепарин без консервантов (Gedeon Richter, Венгрия), среду Игла-MEM (SIFIN, ГДР); L( + )-глутамин (Ferak, Зап. Берлин), ГЭПЭС (N-2-гидроксиэтилпиперазин-N-2-этансульфокислота) (Ferak, Зап. Берлин), стрептомицин, пенициллин G; инактивированную сыворотку АВ или сыворотку эмбрионов коров (Difco, США).

Методика

Перед проведением реакции бласттрансформации лимфоцитов выбирают подходящие антигены и митогены, а также адекватную модификацию теста. Мы использовали в основном 3 модификации теста.

Этапы работы при различных модификациях реакции бласттрансформации лимфоцитов

Этапы работы при различных модификациях РБТЛ

V — дельная кровь; FV — препарат лимфоцитов, полученный из градиента фиколл — визотраст; LSC — жидкостный сциитилляциоиный счетчик; одной звездочкой обозначен метод с использоеваннем пробирок (вариант II); двумя звездочками— метод с использованием устройства для сбора клеток (вариант I); кружочком — отмывка (см. таблицу ниже)

Следует учитывать, что клетки различных животных не всегда удобны в обращении в такой же степени, как лимфоциты периферической крови человека. Необходимое количество крови очень невелико. После разведения образца раствором Трюка подсчитывают абсолютное число лимфоцитов в счетной камере. В одном флаконе находится 5х104 лимфоцитов. Для получения клеток в градиенте плотности (см. раздел «Разделение клеток иммунной системы») g целью проведения реакции бласттрансформации лимфоцитов требуется примерно в 5 раз больше крови.

Известно, что для оптимальной активации необходимо наличие небольшого числа макрофагов (моноциты), поэтому не рекомендуется использовать высокоочищенные препараты лимфоцитов.

Культивирование и обработка культур. При всех вариантах (см. рисунок выше) культивирование проводят в объеме 200 мкл. В идеале следует лимфоциты цельной крови и препараты лимфоцитом подвергать аналогичной обработке для реакции бласттрансформации лимфоцитов. Оптимальное время культивирования при использовании митогенов составляет 3 дня (для лимфоцитов цельной крови 4 дня), при использовании антигенов — 7 дней. При культивировании в пробирках (см. таблицу «Оснащение для двух различных вариантов РБТЛ», вариант II) используют шуттель-аппарат для ресуспендирования после внесения метки в культуру и перед сбором клеток. Процесс мечения прерывают нанесением 100 мкл суспензии клеток на кружки фильтровальной бумаги. После высыхания отмывают фильтры, по 20— 80 штук в одном стакане. Стакан многократно слегка покачивают, после чего декантируют жидкость.

Отмывка бумажных фильтров с меченым осадком клеток (вариант II)

Отмывка бумажных фильтров с меченым осадком клеток (вариант II)

При использовании микропланшетов и устройств для сбора клеток стадии отмывки ТХУ и метанолом опускают и ограничиваются только отмывкой водой.

Тест с суппрессорными клетками. До настоящего времени не разработано общепризнанной тест-системы для работы с супрессорными клетками. На рисунках представлены два возможных варианта постановки опыта, основанные на воздействии на интенсивность синтеза ДНК.

Вызываемая КонА супрессия поддающихся стимуляции ФГА автологических лимфоцитов из цельной крови (V) или выделенных в системе фиколлвизотраст (FV); (концентрации клеток показаны на рисунке выше)

Вызываемая КонА супрессия поддающихся стимуляции ФГА автологических лимфоцитов из цельной крови (V) или выделенных в системе фиколлвизотраст (FV)

Торможение (другие авторы применяют более высокие дозы КонА).

 

Индекс супрессорных клеток (ИСК) для выявления короткоживущих супрессорных клеток

Индекс супрессорных клеток (ИСК) для выявления короткоживущих супрессорных клеток

 

Оценка результатов

Высушенные фильтры помещают в стаканчики с 10 мл толуолового сцинтиллятора и проводят измерение радиоактивности в жидкостном сцинтилляционном счетчике в диапазоне энергии квантов 1,26—20 кэВ с двумя поддиапазонами (1,26— 6,35 кэВ и 4—20 кэВ). Эффективность счета составляет только 2%, ошибка измерения— 16%. При любой модификации можно ограничиться подсчетом величины имп/мин, не проводя пересчет на расп/мин. Исходная активность для нестимулированных лимфоцитов человека не превышает 200 имп/мин, а для лимфоцитов, выделенных в системе фиколл/визотраст, — 1000 имп/мин (см. первый рисунок). У мышиных клеток (при использовании сыворотки эмбрионов коров) эта величина не превышает 2000 имп/мин. После стимуляции ФГА нормальные лимфоциты цельной крови человека включают метку до величины свыше 104 имп/мин, а лимфоциты, полученные в системе фиколл/ визотраст, — 5х104 имп/мин. Для клеток лимфоузлов мыши после стимуляции ФГА характерны величины порядка 104имп/ /мин. В случае острых заболеваний, для которых характерны повышенные значения включения метки, после 3-дневного культивирования использование индекса стимуляции (ИС) не рекомендуется.

Поскольку не удается уловить неизменно высокий ответ на антигенный стимул, бывает достаточно данных, выраженных просто в имп/мин. Для некоторых болезней характерно изменение уровня выживаемости клеток (например, при лейкемиях до 400% по сравнению с 70%, характерными для 3-дневного культивирования у нормальных людей). В этих особых случаях рекомендуется соотносить реактивность клеток с их числом.

Толуоловый сцинтиллятор можно использовать многократно с условием, что его радиоактивность не будет превышать 50 имп/мин на 1 стакан (10 мл). Тщательно отмытые стаканы заполняют свежим сцинтиллятором и перед использованием определяют уровень фона. Данные о суппрессорах см. рисунки "Вызываемая КонА супрессия поддающихся стимуляции ФГА автологических лимфоцитов из цельной крови (V) или выделенных в системе фиколлвизотраст (FV)" и "Индекс супрессорных клеток (ИСК) для выявления короткоживущих супрессорных клеток". В цельной крови индуцированная КонА супрессия достигает 50%, при использовании препарата лимфоцитов, полученных в системе фиколл/визотраст, — 24%. У нормальных людей эти данные сильно колеблются, их интерпретация возможна только в динамике. Индекс супрессорных клеток у здоровых людей составляет около 2,45.