Главная


артистичные рецепты

Реакция миграции лейкоцитов под слоем агарозы. Методика

Материалы и оборудование

Для работы нужно иметь: раствор Хенкса или ФСБ с рН 7,3; среду Игла-МЕМ с 5% инактивированной сыворотки (лошадиная, телячья, человеческая АВ сыворотка, лошадиная и телячья сыворотка, адсорбированная на человеческих эритроцитах АВ, с добавлением пенициллина (60 ЕД/мл), стрептомицина (60 мг/л), NaHC03 (150 мг/л), рН 7,3 (лучшего буферного эффекта можно достигнуть добавлением 10 ммоль/л ГЭПЭС, Сигма, США, с подведением рН до 7,3, NaOH в концентрации 5 моль/л), агарозу, гепарин (желательно без консервантов, например, Gedeon Richter, Будапешт), декстран (например, Infukoll 6%, сывороточный з-д Bernburg, ГДР), метанол, 35% формалин. Также необходимы центрифужные пробирки с коническим дном на 10 мл и круглым дном на 20 мл, пастеровские пипетки, штампы для вырезания отверстий в агарозе (2,0— 2,5 мм), микрошприцы (на 50 и 100 мкл), эппендорфовские пипетки (5 и 10 мкл, Hamburg-Eppendorf), чашки Петри стеклянные или пластиковые, предметные стекла или стеклянные пластины, алюминиевая фольга, счетные пипетки и счетные камеры, центрифуги, термостат, стерилизатор, микроскоп, рН-метр, водяной насос, водяная баня, проекционный аппарат (с увеличением 15). Среды стерилизуют фильтрацией, стеклянные предметы — в сухожаровом шкафу, пластмассовое оборудование автоклавируют. Для непрямой РМЛА (культивирование лимфоцитов) дополнительно используют визотраст 370 (Fahlberg List, ГДР), фиколл 400 (Pharmacia, Швеция).

Подготовка пластин с агарозой

Размешивают 1 г агарозы в 45 мл дистиллированной воды, расплавляют на кипящей водяной бане и охлаждают до48°С. Затем добавляют 45 мл среды Игла (двойная концентрация) и 10 мл сыворотки, предварительно нагретых до 48 °С. Теплый раствор агарозы быстро разливают в чашки Петри (по 25— 30 мл в чашки диаметром 10 см), на обезжиренные стеклянные пластины размером 76х97 мм (по 16 мл) или по 8 мл в счетные камеры Neubauer.

Пластины с агарозой можно сохранять во влажной камере при 4°С. Перед внесением суспензии в агарозе проделывают отверстия при помощи штампа.

Оборудование для анализа миграции лейкоцитов в слое агарозы

Оборудование для анализа миграции лейкоцитов в слое агарозы

1 — игла для вырезания цилиндров агарозы (плоский срез, диаметр 2,5 мм);
2 — шаблон для лунок (30 отверстий, ограничительный край);
3 — стеклянная пластина после удаления слоя агарозы, высушивания на воздухе и фиксации зон миграции;
4 — сосуд для стеклянных пластин при валивке агарозы

Вырезанные цилиндры агарозы удаляют при помощи пипетки, соединенной с водяным насосом.

Прямая РМЛА

К гепаринизированной крови (30 МЕ/мл) добавляют 6% инфуколл (4 мл на 16 мл крови), разливают в узкие (по возможности) пробирки и оставляют стоять в течение 1 ч при 37 °С для спонтанной седиментации. Надосадочную жидкость, содержащую лейкоциты, отсасывают, осаждают клетки центрифугированием в течение 10 мин при 150g. Клетки дважды отмывают в ФСБ и один раз в среде Игла (8 мин, 100g). Готовят суспензию, состоящую из 2,0—2,5x108 лейкоцитов/мл в среде Игла с 10% сыворотки. Для предотвращения снижения рН, обусловленного метаболизмом клеток, к каждому мл суспензии добавляют по 5 мкл 1,8 М NaHCO3. На дно центрифужных пробирок объемом 10 мл вносят по 10 мкл среды Игла (контроль) или раствора антигенов в среде Игла (проба), к ним добавляют по 40—70 мкл суспензии лейкоцитов. Пробирки закрывают резиновыми пробками и инкубируют при 37 °С при постоянном встряхивании не менее 45 мин. По окончании инкубации клетки ресуспендируют. Содержимое каждой пробы делят на аликвоты по 10 мкл и заполняют ими 3—5 отверстий в агарозе. Пластины с агарозой инкубируют 18 часов при 37°С. Из 16 мл крови пациента получается количество лимфоцитов, достаточное для постановки 4 проб. Рекомендуется использовать модификацию, в которой вместо 10 мкл используют 100 мкл разведения антигена. После первого этапа инкубации клетки осаждают центрифугированием (5 мин, 30g) и готовят суспензию необходимой плотности.

Непрямая РМЛА

Получение надосадочной фракции культуры лимфоцитов (1 фаза): 10 мл гепаринизированной крови испытуемого субъекта смешивают со средой Игла (1 + 1), наслаивают в центрифужные пробирки на слой смеси фиколла и визотраста с плотностью 1,077 (85,5 мл 6% фиколла+14,5 мл визотраста 370) и центрифугируют 20 мин при 350 g. Отсасывают интерфазу, содержащую лимфоциты, клетки дважды отмывают ФСБ и один раз средой Игла (центрифугирование по 10 мин при 150g), готовят суспензию в среде Игла 2х106 лимфоцитов/мл. Аликвоты по 0,45 мл этой суспензии инкубируют 24 ч при37°С со средой Игла (контроль) или с 0,05 мл антигена (проба). Культивирование проводят в центрифужных пробирках, закрытых силиконовыми пробками, по окончании культивирования их центрифугируют 10 мин при 200g. Бесклеточную надосадочную фракцию (БНФ) осторожно отбирают и непосредственно используют во 2-й фазе или хранят при —20 °С.

Исследование надосадочной фракции культуры лимфоцитов (2 фаза): в соответствии с вышеописанным способом из гепаринизированной донорской крови получают суспензию лейкоцитов с концентрацией 2,0—2,5х108 клеток/мл. В конических центрифужных пробирках смешивают по 100 мкл исследуемой БНФ с 10 мкл среды Игла (проба) и, соответственно, 100 мкл контрольной БНФ с 10 мкл раствора антигена (контроль). В контрольную пробирку вносят такое же количество АГ, какое уже содержится в пробирке с исследуемой БНФ, для выявления возможных реакций со стороны лимфоцитов донора. С каждой исследуемой пробой параллельно ставят соответствующую контрольную. Количество контрольной БНФ также должно составлять 400 мкл. К БНФ добавляют по 70 мкл суспензии клеток. Работу с пластинами агарозы проводят как описано выше. Для оценки величины миграции лейкоцитов донора ставят отрицательный контроль с индикаторными лейкоцитами, с средой Игла, с сывороткой вместо БНФ. Если по результатам прямой РМЛА и всех видов контроля показано, что использованный антиген в различных дозировках не вызывает реакции лейкоцитов различных доноров, то можно отказаться от постановки параллельных контрольных проб и ограничиться одной пробой на каждой пластине с агарозой. Это существенно снижает издержки анализа.

Оценка результатов

Диаметр большей части циркулярных зон можно определять при помощи линейки в рассеянном свете. Для сохранения результатов исследования пластины агарозы инкубируют 30 мин с метанолом и 30 мин с 35% формалином, ополаскивают водой. Слой агарозы осторожно отделяют от пластины скальпелем. Пластины или чашки Петри с агарозой можно высушивать на воздухе, в таком виде они хранятся практически неограниченное время. Оценку зон миграции можно в этом случае проводить при помощи проекционного аппарата. Исходя из среднего диаметра, рассчитывают среднюю площадь зоны миграции в пробе (возможна также планиметрия или вырезание и взвешивание зон миграции). Индекс миграции (ИМ) рассчитывают по следующей формуле:

                   средняя площадь зоны миграции в присутствии АГ
ИМ =                                                                                                                                            
                    средняя площадь зоны миграции без АГ

Для фотографирования пластин рекомендуется контрастное окрашивание, например 5% эозином.