Главная


Купить косметический прибор

Реакция торможения адгезии лейкоцитов. Методика

Материалы и оборудование

Растворы для сепарирования клеток: среда Игла, раствор Хенкса, изотонический буфер с рН 7,3 (Институт иммунных препаратов и питательных сред, Берлин), гепарин, лимфопреп (Nyegaard, Норвегия) или фиколл — гипак (Pharmacia, Швеция).

Оснащение для приготовления антигенов: гомогенизатор, ультрацентрифуга, диализные мешки.

Посуда: сосуды с частично плоской поверхностью (ЗОХ Х13 мм), пластиковые сосуды с плоским дном, микропланшеты (например, Falcon N 3034).

Подсчет клеток: камеры для подсчета клеток (Biirker, Thoma и др.); микроскоп, прибор для счета клеток (например, Picoscale, Medicor, Венгрия); кроме того, необходимы термостат, центрифуги и различная стеклянная посуда.

Приготовление клеток

В РТАЛ можно использовать как лейкоциты, так и лимфоциты. Мы предлагаем следующую простую модификацию: отслоив-шуются после спонтанной седиментации гепаринизированной крови (30-40 мл) плазму наслаивают на лимфопреп. После центрифугирования (20 мин, 150 g) слой лимфоцитов, содержащийся между плазмой и лимфопрепом, отсасывают. Клетки трижды отмывают в изотоническом буфере и суспендируют в среде Игла. При работе с животными можно использовать клетки лимфатических узлов или перитонеалъного экссудата. Можно также использовать спленоциты. Перед подсчетом клеток необходимо лизировать эритроциты. Суспензию клеток лимфатических узлов и селезенки получают путем продавливания этих органов через тонкое металлическое сито или осторожного растирания в стеклянном гомогенизаторе. Фильтрованием через слой марли или капроновой сетки удаляют агрегаты клеток. Клетки человека выделяют при комнатной температуре, поскольку на холоду они склонны к агрегации. Препараты клеток мыши получают при 4°С.

Антигены

Антигенсодержащие экстракты из опухолевых, эмбриональных и других тканей выделяют различными методами. Широкое распространение получило экстрагирование ЗМ KCI, также используется выделение препаратов мембран и экстракция изотоническим раствором хлорида натрия. Для экстракции изотоническим раствором NaCl ткань измельчают ножницами, смешивают в соотношении 1 + 4 с буфером (ФСБ) и гомогенизируют (гомогенизатор Уорринга, Поттера или Ultra-Turrax). Центрифугируют 10 мин при 1000—3000 g, собирают надосадочную фракцию и центрифугируют 30 мин при 20 000 g (можно больше). Полученную прозрачную надосадочную фракцию замораживают небольшими аликвотами при —20 °С. Если после размораживания образуется нерастворимый осадок, его удалят центрифугированием. В качестве рабочей концентрации в РТАЛ используют разведение, которое дает значимые различия между пробами от сенсибилизированных и несенсибилизированных доноров. Для экстрактов тканей эта величина составляет в среднем 50—500 мкг белка на пробу.

Проведение РТАЛ

Метод «счетной камеры». Смешивают 106 лейкоцитов в 0,05 мл среды с 0,05 мл препарата АГ (в контроле просто среда) и с 0,1 мл нормальной сыворотки. Пробирки закрывают и инкубируют на водяной бане 30 мин при 37°С. Через каждые 5 минут содержимое пробирок встяхивают. После инкубации суспензию вносят в счетную камеру пастеровской пипеткой. Камеру выдерживают 1 минуту при 37 °С в водонасыщенной атмосфере (чашка Петри со смоченным куском фильтровальной бумаги). Подсчитывают клетки. В квадрате 0,2х0,2 мм должно содержаться 15—25 клеток. Подсчитывают клетки в 5 квадратах. Затем отмывают неадгезированные клетки (процедура требует особого навыка). Счетную камеру помещают в горизонтальном положении в сосуд с физиологическим раствором и осторожно снимают покровное стекло. Камеру бережно извлекают и на короткое время помещают в вертикальном положении в сосуд с изотоническим раствором. Затем в камеру добавляют 1 каплю среды и покрывают чистым покровным стеклом. Через 1—2 часа подсчитывают адгезированные клетки в тех же 5 квадратах, определяют процент адгезированных клеток.

Адгезия лимфоцитов опухоленосителя в контроле без антигена (а), и в пробе с эмбриональным антигеном (б)

Адгезия лимфоцитов опухоленосителя в контроле без антигена (а), и в пробе с эмбриональным антигеном (б)

Добавлением исследуемой сыворотки (0,1 мл) вместо нормальной можно выявлять блокирующие или деблокирующие адгезию сывороточные факторы.

«Пробирочный» вариант РТАЛ. Суспендируют 106 клеток совместно с АГ в конечном объеме 0,5 мл в специальном сосуде, имеющем частично плоскую поверхность, на которой он стоит. Клеток должно быть немного, чтобы не мог образоваться монослой лимфоцитов на плоской поверхности. После инкубации в горизонтальном положении (2 ч, 37 °С) сосуды ставят вертикально, осторожно ополаскивают плоскую поверхность суспензией клеток. После перемешивания суспензию переносят пастеровской пипеткой в счетную камеру и подсчитывают неадгезировавшие клетки.

Схема постановки РТАЛ (подсчет неадгезировавших клеток)

Схема постановки РТАЛ (подсчет неадгезировавших клеток)

Прочие модификации. Модификации, как правило, преследуют цель ускорить проведение анализа. Для этого индикаторные капли метят радиоактивными изотопами и применяют автоматизированный подсчет адгезированных и неадгезированных клеток ). Кроме того, РТАЛ проводят в микропланшетах или капиллярах с целью уменьшения расхода клеток или антигена. Микропланшеты можно анализировать даже при помощи соответствующей программы на ЭВМ.

Подсчет результатов. В контрольных пробах смешивают лимфоциты несенсибилизированного донора со специфическим АГ, исследуемые лимфоциты со средой или с неспецифическим антигеном. Торможение адгезии (ТА) оценивают по следующей формуле:

Для оценки результатов «пробирочного» метода часто используют такой показатель, как индекс неадгезировавших клеток (ИНА).

Границу между специфическим и неспецифическим торможением адгезии устанавливают статистически или эмпирически по сравнению с реакцией лимфоцитов сенсибилизированных и несенсибилизированных доноров.