Главная


мусульманский приворот

Реакция торможения распластывания макрофагов. Методика

Материалы и оборудование

Для работы необходимы вазелиновое масло для инъекций (Leuna-Werke, ГДР); солевой раствор Хенкса с рН 7,4 (варианты с добавлением и без добавления 5 ME безфенольного препарата натриевой соли гепарина на 1 мл); среда Игла с рН 7,4 с добавлением 100 ME пенициллина/мл и 100 мкг стрептомицина/мл; 0,01 мл инактивированной гомологичной нормальной сыворотки и 0,02 мг L-глутамина; ФСБ с рН 7,4; легкоплавкий парафин для монтажа камер для культивирования; 0,2% раствор трипанового синего в 0,15 М NaCl; красящий раствор по Паппенгейму (Medizin-chemie, Лейпциг, ГДР). Фиксирующая смесь по Bouin (30 частей водонасыщенной пикриновой кислоты, 10 частей формола, 2 части ледяной уксусной кислоты, специфический АГ, в данном случае бычий -γ-глобулин (Bekringwerke); полный адъювант Фрейнда (ПАФ) (Difco, США); шприцы для инъекций на 1 мл, 10 мл, 20 мл, центрифужные пробирки, градуированные пипетки (0,2—5,0 мл), пипетки для подсчета лейкоцитов, счетная камера Neubauer, предметные стекла, покровные стекла 20х45 мм, плоские шлифованные стеклянные кольца, клейкая лента постоянной толщины (Atlas Plastic Таре, 0,2 мм толщиной, 19 мм шириной), сухожаровой шкаф, автоклав, стеклянный стерилизующий фильтр G5 (Saale-Glas, Йена), устройство для мембранного фильтрования, шприц для мембранных фильтров на 5 мл (Sartorius, ФРГ), мембранные фильтры с диаметром пор 0,40 мкм (Sartorius, ФРГ), термостат, фазово-контрастный микроскоп (Carl Zeiss, Иена), денситрон (Центральный институт изотопов и ионизирующего излучения, Лейпциг).

Растворы стерилизуют фильтрацией и хранят при 4°С, центрифужные пробирки силиконизируют (помещают на 24 ч в смесь 1 части эмульсии силиконового масла NE 4 (Химический завод Niinchritz, ГДР) и 4 частей дистиллированной воды, отмывают пробирки водопроводной водой, высушивают на воздухе, а затем 1 час при 200 °С). Все прочие стеклянные части автоклавируют или обрабатывают в сухожаровом шкафу при 180 °С.

Монтаж камеры для культивирования

Для инкубации КПЭ особенно удобны камеры, изображенные на рисунке ниже.

Камера Cunningham для культивирования КПЭ в реакции торможения распластывания макрофагов

1 — пипетка с супензией клеток; 2— предметное стекло; 3 — пластиковая леита «Atlas Plastic Таре»;
4 — клейка лента; 5 — покровное стекло (45х22 мм); 6 — герметизация расплавленным парафином

На обезжиренное предметное стекло на расстоянии 20 мм наклеивают 2 полоски клейкой ленты. Сверху кладут покровное стекло и также укрепляют клейкой лентой. Между предметным и покровным стеклом образуется полость с постоянным объемом, которую по краям герметизируют горячим парафином. Эту полость заполняют сусупензией клеток. Для формирования камер также удобно использовать двустороннюю клейкую ленту (Scotch № 410). В некоторых модификациях метода используют «открытые» камеры. Плоские стеклянные кольца прикрепляют при помощи горячего парафина к предметным стеклам, при этом образуется полость вместимостью около 0,5 мл. После внесения суспензии клеток кольца прикрывают сверху покровным стеклом без герметизации.

Получение клеток перитонеального экссудата

Через 5 дней после внутрибрюшного введения 10—20 мл вазелинового масла морских свинок забивают и полость брюшины промывают 50 мл холодного раствора Хенкса, содержащего 5 ME гепарина/мл. Суспензию клеток собирают в силиконизированные центрифужные пробирки и трижды отмывают раствором Хенкса без гепарина (центрифугирование 10 мин, 150 g). После подсчета количества неживых клеток готовят суспензию клеток в культуральной среде (5х106/мл).

Проведение исследования в камере

Суспензию клеток делят на две части по 0,5 мл. Одна из проб изготовлена на чистой культуральной среде, другая — на среде с добавкой 5 мг бычьего γ-глобулина. Обе пробирки инкубируют 30 мин при 37°С в термостате, желательно при постоянном встряхивании. После инкубации берут две камеры для пробы, две для контроля. Герметизацию камер проводят горячим парафином при помощи кисточки. Герметизированные камеры инкубируют еще 2 часа при 37 °С в горизонтальном положении. Результаты оценивают при помощи фазово-контрастной микроскопии. Все клетки, имеющие псевдоподиеподобные выступы и темную окраску, рассматриваются как мигрирующие.

Фазово-контрастная микроскопия КПЭ в камере Cunningham

Фазово-контрастная микроскопия КПЭ в камере Cunningham

Время инкубации 2 ч без добавления АГ. L — лимфоцит; r1 — округлившийся макрофаг;
r2 — макрофаг, состояние которого нельзя оценить однозначно; остальные клетки можно отнести к категории распластанных

В каждой камере считают по 200 клеток. Расчет индекса торможения (ИТ), или, соответственно, процент торможения проводят по следующей формуле:

Процент торможеиия = (1 — ИТ) х 100.

Проведение исследования в открытой камере и денситометрический анализ

Различия касаются только формы камер и зависящей от нее меньшей концентрации суспензии клеток. После инкубации пробирок и камер кольца удаляют, предметные стекла споласкивают ФСБ и фиксируют по Bouin (10 минут при комнатной температуре). Затем окрашивают препарат по Паппенгейму и микроскопируют. Подсчет и оценку результатов см. выше. Более объективные и точные результаты получаются при оценке величины макрофагов на энкстроне, электронно-оптическом приспособлении, разработанном в ГДР.

Комплекс приборов, составляющих деиситрон:
телекамера (в данном случае соединена с микроскопом), дисплей и печатающее устройство

Комплекс приборов, составляющих деиситрон

Сего помощью можно быстро провести эквиденситометрическое определение площади отдельных макрофагов и оценить относительную частоту встречаемости макрофагов разной величины (мкм2) в пробе и в контроле. На рисунке ниже показано влияние лимфокинсодержащей БНФ на распластывание макрофагов по стеклянной поверхности.

Относительная частота встречаемости различных размеров макрофагов

Относительная частота встречаемости различных размеров макрофагов

1 — в контроле; 2 — в исследуемой группе.
При помощи денситометра было измерено 231 и 325 клеток соответственно

Сдвиг пика в кривой распределения совершенно очевиден, полученное различие в высокой степени достоверно.