Главная


вакуумные усилители тормозов
зеркальное панно купить

Выделение иммуноглобулина G (IgG)

Принцип метода

В отличие от иммуноглобулинов других классов IgG сравнительно просто выделить в чистом виде. Выделение проводят путем осаждения сульфатом аммония и хроматографии на анионообменниках, например ДЭАЭ-целлюлозе или ДЭАЭ-сефадексе. Исходным материалом служит сыворотка. IgG представляет собой гетерогенную смесь иммуноглобулинов с похожими характеристиками, эти Ig можно разделить на анионообменниках, изменяя ионную силу элюента. Часто перед проведением хроматографии проводят осаждение сульфатом аммония или риванолом (2-эток-си-6, 9-диаминоакридинлактат).

Получение препаратов с повышенным содержанием IgG

Осаждение сульфатом аммония. К 100 мл сыворотки добавляют 50 мл насыщенного раствора сульфата аммония. Осадок удаляют центрифугированием, растворяют в 50 мл дистиллированной воды и снова осаждают 25 мл насыщенного раствора сульфата аммония. Осаждение повторяют 4—5 раз. Затем препарат диализуют против соответствующего буфера. Иногда осаждение проводят при 40% насыщении соли, что увеличивает выход, но снижает чистоту препарата. Иногда насыщение сульфата аммония выражают в молях; насыщенный раствор при 0°С соответствует 3,9 М (514,72 г в 1 л), при 20°С —4,06 М (536,34 г в 1 л).

Осаждение сульфатом натрия. К 100 мл сыворотки при комнатной температуре добавляют 18 г сульфата натрия (при 4°С растворимость сульфата натрия уменьшается). Осадок растворяют в 40 мл фосфатного буфера с рН 8,0 и ионной силой 0,1. Переосаждают белок, прибавив 4,8 г сульфата натрия. Осадок после центрифугирования растворяют в 20 мл фосфатного буфера (см. выше) и переосаждают 2,4 г сульфата натрия. Выпавший осадок отделяют, растворяют в небольшом количестве буфера, диализуют.

Осаждение риванолом. Риванол образует с сывороточными белками комплексы, которые выпадают в осадок, но растворяются при рН 5. Ввиду высокой изоэлектрнческой точки IgG по сравнению с остальными сывороточными белками в слабощелочной среде риванол не образует комплексов с IgG. На этом основана очистка IgG. К сыворотке добавляют раствор риванола (7,5 г/л) при постоянном перемешивании. Осадок удаляют центрифугированием. IgG остается в надосадочной фракции. Риванол можно удалить активированным углем (10 мг/мл) или NaCl (до 50 г/л). Соотношение сыворотки и риванола может быть различным. Наилучшее соотношение сыворотка/риванол при выделении человеческого IgG равна 1+2. На один объем сыворотки животных берут 1—1,5 объема риванола. При обработке сыворотки человека используют даже соотношение 1+3—3,5.

Фракционирование органическими растворителями. У этого вида фракционирования есть недостаток: необходим строгий контроль температуры и рН. Поскольку органические растворители легко вызывают денатурацию, необходимо проводить работу при температуре ниже 0°С. Чаще используют этанол при фракционировании белков плазмы человека. В лаборатории к фракционированию этанолом прибегают редко, однако в промышленности этот метод нашел широкое применение. Так называемая II фракция по Кону состоит в основном из IgG.

Получение IgG из сыворотки человека

Материалы и оборудование. Для работы необходимы сыворотка человека, ДЭАЭ-сефадекс (Pharmacia, Швеция), 0,1 М и 0,01 М фосфатный буфер с рН 6,5, 0,1 М Н3Р04, 0,5 М NaOH, 1 М К2НРО4, 1 М NaCl.

Методика. Дают ДЭАЭ-сефадексу А-50 набухнуть, мелкие частицы декантируют. Отмывают 0,5 М NaOH до тех пор, пока промывная жидкость не освободится от ионов хлора. Отмывают сорбент водой до достижения нейтрального рН. При помощи 0,1 М фосфорной кислоты переводят обменник в фосфатную форму. Добавляют такое количество кислоты, чтобы надосадочная фракция имела выраженную кислую реакцию. Отмывают избыток кислоты дистиллированной водой, уравновешивают сорбент 0,1 М фосфатным буфером с рН 6,5, затем 0,01 М фосфатным буфером с рН 6,5. К 100 мл сыворотки человека добавляют 20 г набухшего уравновешенного ДЭАЭ-сефадекса А-50. Сыворотку можно предварительно продиализовать против 0,01 М фосфатного буфера с рН 6,5. Смесь периодически суспендируют в течение часа (4°С). Затем фильтруют и 4 раза отмывают порциями 0,01 М буфера по 50 мл. Фильтрат и промывную жидкость объединяют н снова инкубируют с 20 г ДЭАЭ-сефадекса в тех же условиях.

Снова фильтруют и отмывают 0,01 М фосфатным буфером. Доводят рН с помощью 1 М К2НРО4 до 7,5 для предотвращения образования нерастворимого продукта. Раствор IgG диализуют против дистиллированной воды, после чего его лиофилизируют. После лиофилизации IgG приобретает склонность к агрегации. Использованный сефадекс регенерируют 1 М NaCl, 0,5 М NaOH и этанолом. Этанол удаляет адсорбированные липиды. Избыток щелочи отмывают дистиллированной водой, после чего ионообменник переводят в фосфатную форму как было описано выше.

Обсуждение. Метод приготовления IgG из сыворотки человека состоит по существу из одного этапа. Хроматография на колонке является более эффективным методом, чем метод спонтанной седиментации (англ. Batch method). Однако ввиду того, что гель изменяет объем в зависимости от ионной силы, регенерация геля непосредственно на колонке невозможна, гель приходится выбивать из колонки. При получении больших количеств IgG желательно до хроматографии провести еще одну стадию очистки. Возможно также использовать для хроматографии QAE-сефадекс, объем гранул которого не зависит от рН. В качестве элюента используют смесь этилендиамида и уксусной кислоты с рН 7,0, ионной силой 0,1; регенерируют сорбент натрий-ацетатным буфером с рН 4,0 с ионной силой 0,1. Липопротеиды удаляют 5% раствором твина-80 в ацетатном буфере. Этилендиамин-ацетатный буфер улетучивается при лиофилизации, что является преимуществом. Перед лиофилизацией концентрацию IgG доводят до 30 г/л, так как в случае меньших концентраций образуются нерастворимые продукты. Протеин А из клеточной стенки Staphylococcus aureus осаждает IgG 1,2 и 4, но не IgG3. Формалинизированную культуру золотистого стафилококка можно использовать для специфической очистки IgG3. IgG 1,2 и 4 можно десорбировать с иммобилизованного протеина А при помощи глицин-солянокислого буфера с рН 3,0, а также электрофоретически. Градиентом рН удается десорбировать IgG 1 и 2 с протеин-А-сефарозы с 90% и 95% чистотой соответственно. Подклассы IgG можно также выделить при помощи антисывороток со специфичностью к отдельным подклассам, конъюгированных с бромциансефарозой.

Выделение IgG из сыворотки кролика

Очистку IgG кролика можно осуществлять в следующих условиях:

а) хроматографию проводят на ДЭАЭ-целлюлозе в 0,01 М фосфатном буфере с рН 8,0 или в 0,0175 М фосфатном буфере с рН 6,3. Перед хроматографией сыворотку диализуют против соответствующего буфера. Элюируется чистый IgG, остальные белки задерживаются на колонке;

б) после хроматографии на ДЭАЭ-сефадексе А-50 в 0,0175 М фосфатном буфере с рН 6,3, на ДЭАЭ-целлюлозе в 0,0175 М фосфатном буфере с рН 6,9 или в 0,025 М фосфатном буфере с рН 6,9 IgG осаждают сульфатом натрия;

в) трехкратно осаждают IgG сульфатом аммония (конечная концентрация 1,35 М) при рН 7,0, проводят диализ против дистиллированной Н2О. Хроматографируют белок на ДЭАЭ-целлюлозе в 0,02 М фосфатном буфере с рН 7,2;

г) осаждают IgG сульфатом аммония в конечной концентрации 37, 40 или 43% насыщения с последующей хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе в 0,0175 М фосфатном буфере с рН 6,3;

д) предварительно осаждают IgG сульфатом аммония или риванолом, затем хроматографируют на ДЭАЭ-целлюлозе. Элюирование проводят фосфатными буферами:

1) 0,0175 М с рН 6,9;
2) 0,035 М с рН 7,5;
3) 0,05 М с рН 7,5. Фракции 1 и 2 представляют собой чистый Ig, фракцию 3 очищают гель-фильтрацией на сефадексе G-200 (0,2 М трис, 0,5 М глицин, рН 8,2).

При хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе или ДЭАЭ-сефадексе А-50 IgG кролика удается разделить на 2 фракции, «медленную» и «быструю» (по электрофоретической подвижности). Сыворотку диализуют против стартового буфера (0,035 М трис, 0,005 М фосфорная кислота рН 8,4), хроматографируют на ДЭАЭ-целлюлозе в этом же буфере. При этом элюируется «медленный» IgG. Если вести дальше элюцию смесью 0,5 М трис — 0,59 М фосфорная кислота с рН 4,0, то вначале появляется пик, отражающий содержание чистого «быстрого» IgG, затем элюируется «быстрый» IgG в смеси с другими сывороточными белками. При хроматографии сыворотки на ДЭАЭ-сефадексе А-50 также можно выделить две фракции IgG, идентичные иммуноэлектрофоретически, но различающиеся по подвижности при электрофорезе. Первую фракцию выводит стартовый буфер, вторая элюируется градиентом 0,2—0,3 М фосфатного буфера с рН 8,0. Соотношение величин обеих фракций зависит от молярности стартового буфера.

Выделение IgG из куриной сыворотки

IgG из куриной сыворотки получают трехкратной преципитацией сульфатом натрия (180, 140 и 125 г/л) с последующей хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе в 0,05 М фосфатном буфере с рН 8,0.

Выделение IgG из сыворотки лошади

Лошадиный IgG готовят методом ионообменной хроматографии из нормальной сыворотки на ДЭАЭ-целлюлозе в 0,01 М фосфатном буфере с рН 8,0. Дальнейшую очистку можно проводить осаждением сульфатом аммония при 37% насыщения с последующей доочисткой на ТЭАЭ-целлюлозе в 0,00525 М фосфатном буфере. IgG можно выделить из нормальной сыворотки лошади на ДЭАЭ-сефадексе в 0,0175 М фосфатном буфере с рН 6,3. Если в идентичных условиях выделять IgG из иммунной сыворотки, получается препарат, загрязненный IgG (Т).

В ходе рехроматографии на ДЭАЭ-сефадексе А-50 в 0,015 М фосфатным буфере с рН 8,4 IgG не адсорбируется, a IgG (Т) задерживается на колонке, откуда он может быть элюирован градиентом фосфатный буфер 0,015 М с рН 8,4 — фосфатный буфер 0,175 М с рН 6,3. Выделенный таким образом IgG (Т) содержит примесь IgG, которую удаляют методом зонального электрофореза. IgG (Т) ранее называли IgA (Т), Т-глобулином или А-глобулином. Тяжелая цепь IgG (Т) имеет общие детерминанты с IgG лошади других подклассов (IgG а, b, с) лошади и при ионообменной хроматографии элюируется вслед за IgGa,b, с. IgG a, b элюируется с 0,005—0,01 М фосфатным буфером с рН 8,0, IgG с — 0,02 М фосфатным буфером с рН 8,0.

Выделение IgG из сыворотки морской свинки

Фракция 7S иммуноглобулинов морской свинки разделяется на 7S γ1 («быстрая») и 7S γ2 («медленная»). Их антигенные детерминанты несколько отличаются друг от друга, так же как и их биологические свойства. Так, например, 7S γ1 в отличие от 7S γ2 вызывают реакцию пассивной кожной анафилаксии у морских свинок. Обе фракции осаждают из сыворотки при 50% насыщении сульфатом аммония. Их разделяют на ДЭАЭ-целлюлозе, проводя ступенчатое элюирование фосфатными буферами: 0,005 М с рН 8,0, 0,01 М с рН 6,3, 0,04 М с рН 6,0, 0,1 М с рН 5,8, 0,3 М с рН 5,4. При этом фракция  γ2 элюируется 0,005 М буфером, фракция γ1—0,1 М. Обе эти фракции могут быть разделены на подфракции γ2а и -γ2b, соответственно γ1а и γ1b.

Выделение IgG из сыворотки крупного рогатого скота

Из сыворотки крупного рогатого скота при помощи ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-сефадексе А-50 был выделен IgG 2 (известно два подкласса IgG: IgG 1 и 2). Элюцию проводят градиентом 0,01 М трис-HCl с рН 8,6—0,7 М трис-HCl с рН 8,6. Первый пик представляет собой чистый IgG 2. При помощи буфера, содержащего 0,001 М ЭДТА, IgG 1 выделяют из молозива. После обезжиривания и удаления казеина проводят хроматографию на ДЭАЭ-сефадексе А-50; собирают последнюю порцию элюата, не содержащую IgG 2, концентрируют ее и очищают на сефедексе G-200. Первая часть пика 7S содержит чистый IgG 1.

Выделение IgG из сыворотки  крыс и мышеи

Различают 4 подкласса IgG крыс: IgG 1, IgG 2а, 2b, IgG 2с, которые можно выделить из сыворотки или асцитической жидкости крысы с соответствующей миеломой. У мыши также описаны 4 подкласса IgG: IgG 1, IgG 2а, IgG 2b и IgG3. Их выделяют из сыворотки мышей с миеломой. Для этого можно использовать зональный электрофорез с последующей электрофокусировкой. Из нормальной мышиной сыворотки IgG получают преципитацией сульфатом аммония (20—30% насыщения) с последующей ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе в 0,01 М фосфатном буфере с рН 8,4. IgG можно также получать фракционированием этанолом по Кону, П-фракцию осаждают сульфатом аммония (50% насыщения), затем проводят хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе в 0,01 М фосфатном буфере с рН 7,5 с 0,015 М NaCl. Довольно часто используют очистку на сефадексе G-200. Хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе не так эффективна для очистки мышиного IgG как для очистки IgG других животных. Мышиный IgG довольно прочие связывается с ДЭАЭ-целлюлозой и элюируется вместе с другими сывороточными белками (0,04 М фосфатный буфер с рН 8,0). Первый пик при низкой ионной силе, который при фракционировании сыворотки человека содержит чистый IgG, здесь сильно загрязнен трансферрином. Лучшие результаты дает зональный электрофорез. IgG 1 и IgG 2 могут быть разделены фракционированием этанолом. Элегантным методом разделения IgG на подклассы может стать иммуноадсорбция фракции 7S из асцитической жидкости, полученной после аллоиммунизации.

В клеточной мембране Staphylococcus aureus содержится протеин А, который связывает IgG 2а, IgG2b и IgG3 мыши, но не IgG 1, IgA или IgM. После адсорбции на протеине А, IgG 1 можно отделить от IgA и IgM хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе.

Выделение IgG из сыворотки свиньи

Подклассы IgG 1 и IgG 2 выделяют в чистом виде из молозива. Удаляют жиры, казеин и липопротеиды (см. разделы 4.1.2), затем проводят хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе, затем гель-фильтрацию на сефарозе 6В. Элюцию с ДЭАЭ-целлюлозы проводят градиентом трис-HCl-буфера с рН 7,4, 0,002 М—0,3 М. IgG 2 элюируется исходным буфером; сначала выходит IgG 1, загрязненный IgG 2, затем элюируются IgG 1, S-IgA и IgM. Эти последние можно получить в чистом виде гель-фильтрацией на сефарозе 6В.

Выделение IgG из сыворотки овцы

Вначале проводят осаждение сульфатом аммония, затем хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе. В 0,025 М трис-HCl-буфере с рН 7,8 IgG 2 не адсорбируется. При элюции линейным градиентом 0,025 М трис-HCl рН 7,8—0,15 М трис-HCl-буфер с рН 7,8 остатки IgG 2 элюируются вместе с IgG 1, затем выходит IgG 1.