Главная


Увлажнители

Выделение иммуноглобулина D (IgD)

Принцип метода

Иммуноглобулин D присутствует в сыворотке в очень низких концентрациях (30 мг/л), по своим физико-химическим свойствам мало отличается от других Ig, что создает определенные сложности при его выделении. В качестве исходного материала используют сыворотки больных IgD-миеломой. Очистка проводится на ДЭАЭ-целлюлозе (градиент фосфатного буфера с рН 8,0 0,01 М —0,3 М), а затем гель-хроматографией на сефадексе G-200 в 0,05 М трис-HCl-буфере с рН 8,0, содержащем 0,2 М NaCl. Вместо сефадекса G-200 можно использовать ультра-гель АсА 34. Фракционирование на ультра-геле позволяет получить очищенный IgD, не содержащий примеси IgG и других белков, имеющих сходную относительную молекулярную массу. Дополнительная хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе в 0,035 М фосфатном буфере с рН 8,0 позволяет получить миеломный IgD в чистом виде с выходом свыше 90%.

Выделение IgD из сывороток больных с дисгаммаглобулинемией

В качестве исходного материала служила сыворотка больного с дисгаммаглобулинемией, характеризующейся повышенным содержанием IgD (1,04 г/л). Концентрация IgM также была повышена (3,1 г/л), содержание IgG составляло 8,9 г/л, IgA не определялся. IgD выделяли по следующей схеме:

Сыворотка

   

Объединение фракций, содержащих IgD и IgM

 Объединение фракций, содержащих IgD

Обсуждение

В ходе гель-фильтрации на сефадексе G-200 IgM элюируется в свободном объеме, за ним следуют IgD, IgE, IgA и IgG. Процесс выделения IgD контролируют методом Оухтерлони или иммуноэлектрофорез а с применением моноспецифических антисывороток. Моноспецифические сыворотки получают иммунизацией экспериментальных животных миеломным IgD, с последующей адсорбцией иммуноглобулином и сывороткой больного с агаммаглобулинемией или небольшим объемом нормальной сыворотки. Довольно часто при выделении IgD из сыворотки больных миеломой наблюдается фрагментация его молекул, обычно при хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе. Протеолиз можно предотвратить добавлением ε-аминокапроновой кислоты. Весь процесс выделения IgD должен проводиться при 4°С.