Главная


Пилинги для лица купить - где купить пилинги для лица.

Иммуносорбенты. Методики

Белково-глутаральдегидный иммуносорбент

Материалы и оборудование. Для работы необходимы водный 2,5% раствор глутарового альдегида, 0,9% раствор NaCl, 1 М фосфатный буфер с рН 7,0, 0,2 М фосфатный буфер с рН 7,3, 0,01 М ФСБ с рН 7,0, 0,1 М глицин-HCl-буфер с рН 2,8, антиген, антисыворотка, гомогенизатор Уорринга, центрифуга, УФ-фотометр (например, VSU 2, Carl Zeiss, Йена), кварцевые кюветы, мешалка, мембранные фильтры (Sartorius 13 200).

Проведение опыта. Растворяют 750 мг белка в 10 мл 0,1 М фосфатного буфера с рН 7,0. При необходимости значение рН подводят 0,1 М HCl или 0,1 М NaOH. К этому раствору добавляют 3 мл 2,5% раствора глутарового альдегида, по каплям, при постоянном перемешивании. Через 3 ч при комнатной температуре образуется гель. Гель измельчают в гомогенизаторе Уорринга в 200 мл 0,2 М фосфатного буфера с рН 7,3. Полученную суспензию центрифугируют 15 мин при 1000 g (4°С). Частицы белка отмывают 0,2 М фосфатным буфером с рН 7,3 до тех пор, пока оптическая плотность смыва при длине волны 280 нм не станет меньше 0,01. Затем гель суспендируют в 200 мл 0,1 М глицин-HCl-буфера с рН 2,8 и снова центрифугируют. Повторяют процедуру три раза. Частицы белка суспендируют в 200 мл ФСБ и осаждают центрифугированием. Этот процесс повторяют до тех пор, пока оптическая плотность смыва при 280 нм не станет равной нулю. Отмытый гель переносят в центрифужные пробирки и добавляют соответствующее количество антисыворотки (антигена). Перемешивают в течение 30 мин при комнатной температуре и оставляют на 1,5 ч. Центрифугируют 15 мин при 1000 g (4°С), надосадочную фракцию отбрасывают. Отмывают гель ФСБ до тех пор, пока оптическая плотность смыва при 280 нм не станет менее 0,01. Затем суспендируют гель в 5 мл 0,1 М глицин-НСl-буфера с рН 2,8 в течение 15 мин, центрифугируют 15 мин при 6000 g (4°С), трижды повторяя эту процедуру. Надосадочные фракции, содержащие очищенный белок, объединяют и пропускают через микропористый стеклянный фильтр G5. Фильтрат диализуют против изотонического раствора хлорида натрия, концентрируют методом вакуумной фильтрации через мембранные фильтры, проводят количественный анализ по Оухтерлони. Гель можно использовать повторно, для этого его отмывают 0,2 М фосфатным буфером с рН 7,3 и хранят при 4°С с добавлением мертиолята.

Иммуносорбенты на основе сефарозы

Метод А. Материалы и оборудование: сефароза 4 В, бромциан, 1 М NaOH, NaHC03, NaCl, H3B03, 1 М уксусная кислота, этаноламин, 1 М HCl, рН-метр. Бромциан ядовит! Работа с ним должна проводиться под тягой.

Проведение опыта. Сефарозу 4 В отмывают дистиллированной водой, суспендируют в равном объеме дистиллированной воды. Под тягой к сефарозе добавляют бромциан (0,3 г на 1 мл сефарозы). Подводят рН до 11,2 с помощью 0,1 М NaOH и оставляют на 12 мин при комнатной температуре. По окончании реакции смесь выливают в 1 г охлажденной до 0 °С 0,1 М NaHC03 с 0,5 М NaCl. После отмывки сефарозу суспендируют в том же растворе и инкубируют с белком при 4°С в течение 16 ч (5— 10 мг белка на 1 мл геля). Реакцию ведут при осторожном перемешивании. Проводят отмывку тем же раствором, суспендируют в 1 М этаноламине с рН 8,0 для насыщения реакционно-способных групп и мешают 2 ч при комнатной температуре. Отмывают 0,1 М NaHC03 с 0,5 М NaCl. Три раза проводят отмывку нековалентно связанного белка.

Каждый цикл состоит из двух этапов:

1) отмывки 0,1 М ацетатным буфером с рН 4,0, содержащим 1 М NaCl;
2) отмывки 0,1 М боратным буфером с рН 8,0, содержащим 1 М NaCl. Иммуноадсорбцию проводят в 0,1 М боратном буфере с рН 8,0, содержащем 0,5 М NaCl.

Метод Б. Материалы и оборудование: сефароза 4 В, Na2C03, бромциан, ацетонитрил, NaHC03, NaCl, Н3В03, 1 М уксусная кислота, 1 М NaOH, мочевина.

Проведение эксперимента: 5 мл сефарозы 4 В отмывают 300 мл дистиллированной воды, затем суспендируют в 15 мл 2 М NaHC03 при 4°С. Растворяют при осторожном помешивании 2 г бромциана в 5 мл ацетонитрила. На ледяной бане при постоянном помешивании к сефарозе по каплям добавляют раствор бромциана в течение 2 мин. Оставляют смесь на 15 мин, затем быстро отмывают 250 мл 0,1 М NaHC03 с рН 9,7, содержащим 0,5 М NaCl, 250 мл дистиллированной воды и снова 250 мл 0,1 М NaHC03 с рН 9,7 с 0,5 М NaCl. Отмывку ведут при 4°С. Конъюгацию проводят с 10 мл раствора белка (3— 4 мл/мл) в 0,1 М NaHC03 (рН 9,7) с 0,5 М NaCl в течение 2 ч при 25 °С при легком перемешивании. Следует избегать интенсивного перемешивания.

Сефарозу выдерживают еще в течение 20 ч при 4°С для инактивации реакционноспособных имидокарбонатных групп, после чего гель отмывают при 4°С:

1) 250 мл 0,00625 М боратного буфера (рН 8,8) с 0,15 М NaCl
2) 50 мл 0,1 М ацетата натрия (рН 4,5) с 0,5 М NaCl
3) 50 мл 2 М мочевины с 0,5 М NaCl
4) 50 мл 0,1 М NaHC03 (рН 9,7) с 0,5 М NaCl

Повторяют весь цикл отмывки. Иммуноадсорбцию проводят на колонке, уравновешенной 0,1 М боратным буфером (рН 8,0) с 0,5 М NaCl.

Десорбция. Колонку тщательно промывают буфером для иммуносорбции (см. выше). Для десорбции чаще всего используют 0,1 М глицин-HCl-буфер с рН 2,8, а также 5 М гуанидин-HCl-буфер или 3,5 М KSCN в 0,15 М NaCl. Элюированные фракции нейтрализуют, если десорбцию проводили первым способом, или диализуют против ФСБ с рН 7,5. Количественную оценку проводят по Оухтерлони или методом иммуноэлектрофореза. Для повторных использований колонку промывают 0,1 М боратным буфером с рН 8,0, содержащим 0,5 М NaCl. В качестве консерванта добавляют азид натрия.

Полезные советы

Хотите сохранить вашу кожу молодой и красивой? Обратите внимание на такое соединение как лактулоза. Лактулоза – олигосахарид, естественное здоровье и красота вашей кожи. Лактулоза нашла широкое применение в профилактике детских болезней, в лечении печени и ЖКТ. Научные исследования показали, что при наличии лактулозы на коже увеличивается активность фермента мурамидазы - лизоцима, являющегося важнейшим агентом неспецифического иммунитета кожи. По этой причине, применение кремов в которых содержится лактулоза, повышает сопротивляемость кожного покрова воздействию патогенной микрофлоры.