Главная


Трейдагротранс, зерновозы.
На http://www.gymna.ru оборудование для ударно волновой терапии.
House Of Sillage Love is in the Air по материалам www.sillage-original.ru.

Конъюгат протеина A с пероксидазой

Принцип метода.

N-сукцинимидил-3-(2-пиридилтио)-пропионат (СППТ) является гетеробифункциональным реагентом. Сукцинимидная часть реагирует с первичными аминогруппами как пероксидазы, так и протеина А. Реакцию проводят раздельно, она сопровождается переносом 2-пиридилдисульфидных остатков. Эти остатки в молекуле пероксидазы восстанавливают. Образующиеся SH-гpyппы реагируют с 2-пиридилдисульфидными остатками протеина А с образованием алифатического дисульфида и пиридин-2-тиона.

Материалы и оборудование.

Для работы необходимы пероксидаза хрена, СППТ, протеин А, дитиотреитол, фосфатный буфер с рН 7,5, NaCl, этанол, сефадекс G-25, G-100, колонка (0,6х40 см).

Методика.

а) Растворяют 1,5 мг пероксидазы хрена в 0,2 мл 0,1 М фосфатного буфера с рН 7,5, содержащего 0,1 М NaCl. К этому раствору быстро добавляют 0,2 мл СППТ в этаноле (700 мкг/мл) при непрерывном перемешивании, которое проводят 30 мин при 25 °С, а затем выполняют гель-фильтрацию на сефадексе G-25 в 0,1 М фосфатном буфере с рН 7,5, содержащем 0,1 М NaCl. Фракции, содержащие пероксидазу, концентрируют до 0,3 мл.

б) Смешивают 1,42 мг протеина с 0,06 мл СППТ в условиях, аналогичных указанным выше. После гель-фильтрации на сефадексе G-25 фракции, содержащие протеин А, концентрируют до-0,3 мл.

в) К пероксидазе, обработанной СППТ, добавляют дитиотреитол до конечной концентрации 0,05 М. Избыток дитиотреитола и образующийся пиридин-2-тион удаляют гель-фильтрацией на сефадексе G-25, смешивают пероксидазу, содержащую свободные SH-группы, и протеин А, содержащий 2-пиридилди-сульфидные группы. Объем пробы составляет 1,3 мл. Пробу инкубируют 20 ч при 25 °С, концентрируют до 0,5 мл. Проводят гель-фильтрацию на сефадексе G-100 (колонка размером 0,6X40 см) в 0,1 М фосфатном буфере с рН 7,5 с 0,1 М NaCl

Дополнительные замечания

Конъюгат протеина А с пероксидазой представляет собой универсальный реагент для ИФА в варианте выявления антител. Протеин А и пероксидаза содержатся в конъюгате в соотношении 1 : 1, выход конечного продукта составляет 62%.