Главная


Посадка семян огурцов в огороде www.kailyard.ru/garden/cucumber

Электрофорез, сортировка и разделение клеток на монослое

Электрофорез клеток
Сортировка клеток
Разделение на монослое
Выбор метода, общая оценка

Три специальных метода разделения клеток будут критически рассмотрены и оценены ниже. Электрофорез клеток и флюоресцентно-активационная сортировка представляют собой сложные методы, требующие специальной аппаратуры, поэтому они не могут быть подробно рассмотрены в настоящей книге. Технология монослоя предполагает наличие отработанной системы культивирования ткани, необходимой для разделения лимфоцитов.

Электрофорез клеток

Находясь в суспензии, под действием постоянного электрического поля клетки мигрируют к аноду. Миграция становится возможной вследствие возникновения электрического потенциала на поверхности клеточных мембран при контакте со средой. Потенциал обусловлен особенностями структуры мембраны. Распределение ионов на мембране и ионизация функциональных групп белков приводит к образованию суммарного отрицательного заряда клеток.

Различные типы клеток обладают неодинаковой электрофоретической подвижностью. Это особенность убывает в следующем порядке: эритроциты, Т-лимфоциты, В-лимфоциты, макрофаги/моноциты. Различия в подвижности Т- и В-лимфоцитов обусловлены различием концентрации нейраминовой кислоты в клеточной мембране. Аналитический электрофорез клеток позволяет получить диаграмму частотного распределения клеток в суспензии по их подвижности. Для каждого органа существует характерная диаграмма с одним или несколькими пиками. Обычно при проведении электрофореза без носителя получают 15—20 фракций, но даже при наличии выраженных пиков имеется их заметное перекрывание. Если взять суспензию спленоцитов мыши, отбросить фракции клеток со средней подвижностью и объединить фракции с соответственно высокой и низкой подвижностью, то можно получить препараты Т- и В-лимфоцитов высокой степени чистоты.

Артефакты. Стимуляцию лимфоцитов в данной системе в принципе можно исключить. Это, пожалуй, и является единственным преимуществом метода, имеющего многочисленные недостатки. К их числу относится низкий выход клеток. Если отбрасывать перекрывающиеся области, возникает вероятность селективных потерь. Выход клеток может снижаться вследствие их агрегации, обусловленной высвобождением ДНК из клеток под действием применяемого буфера. Препаративный электрофорез существенно отличается от аналитического еще и тем, что используется нефизиологичный глициновый буфер с низкой ионной силой и напряжение электрического поля в 15 раз более высокое. Это означает, что ионное облако вокруг клеток и, следовательно, их потенциал существенно изменены, а результаты электрофоретического разделения могут весьма существенно отличаться от результатов аналитического электрофореза.

Сортировка клеток

Этот метод стал универсальным, особенно с того времени, как получила развитие гибридомная технология. Возможно специфическое разделение на основе как антигенов, так и антител, меченных флюорохромами. В плане достигаемой чистоты метод высокоэффективен, но количество клеток, которые могут быть разделены этим методом, крайне незначительно. Цитофлюори-метрия может быть с успехом применена для цитологического анализа и клонирования клеток. К числу недостатков метода относится высокая стоимость оборудования и необходимость использования абсолютно моноспецифических сывороток или моноклональных антител. Существо метода заключается в том, что суспензию клеток, часть из которых мечена флюорохромом, например при помощи ФИТЦ-иммуноглобулинов, пропускают через капиллярную камеру, одновременно освещая их лучом лазера. Проходя через камеру поштучно, клетки флюоресцируют. Детектор флюоресценции связан с клапаном, позволяющим направлять в разные капилляры поштучно флюоресцирующие и нефлюоресцирующие клетки. Таким образом достигается высокая эффективность разделения клеток.

Разделение на монослое

Использование монослоя дает возможность определять у Т-лимфоцитов наличие специфических рецепторов в отношении трансплантационных или опухолевых АГ. В ходе инкубации суспензии клеток с монослоем клеток—мишеней эффекторные клетки связываются с соответствующими рецепторами. Элиминация эффекторных клеток в этих условиях не может быть полной, цитотоксические лимфоциты удаляются лучше, чем нестимулированные.

Артефакты. Следует принимать во внимание ложное разделение, обусловленное блокадой эффекторных клеток вследствие отрыва клеток-мишеней или выделения их антигенов.

Выбор метода, общая оценка

Выбор метода должен определяться поставленной задачей с учетом возможных артефактов.

Сравнительная оценка методов разделения лимфоцитов

Сравнительная оценка методов разделения лимфоцитов

В таблице приведены суммарные данные, характеризующие различные аспекты разделения клеток. Таблица составлена на примере метода образования розеток, но можно использовать любую другую реакцию. Издержки этого метода незначительны в случае простого разделения Т-лимфоцитов, они возрастают, когда в пределах популяции Т-лимфоцитов разделение проводят по наличию Fc-рецепторов для IgG или IgM. Не образующие розетки лимфоциты не дают артефактов (—). В случае розеткообразующих клеток приходится считаться с наличием артефактов ( ++). Общая оценка метода (+) или (—).