Warning: Invalid argument supplied for foreach() in /home/tutvse/rkf-pitomnik.ru/docs/setlinks_9409e/slclient.php on line 182
Иммунология и защита иммунитета. Значение вакцинации для профилактики заболеваний, >> Исследования in vitro

Главная


Исследования in vitro

Разработка воспроизводимых и надежных методов оценки антиген-специфической активации Т-клеток позволила провести аналогичные исследования in vitro. Как и раньше, поглощение белковых антигенов макрофагами определяли с помощью радиоактивных изотопов, а иммуногенность оценивали по способности инкубированных с антигеном макрофагов активировать пролиферацию иммунных Т-клеток in vitro. Хотя результаты исследований in vivo и in vitro в целом были сходны, обнаружился также и ряд отличий, частично изменивших наши представления о процессинге антигена в макрофагах.

Макрофаги, инкубированные с растворимыми белковыми антигенами in vitro, накапливали иммунологически активный антиген по двухступенчатому механизму. Первый этап включал связывание молекул антигена с поверхностью макрофагов; этот этап не зависел от температуры. Потенциальная иммуногенность молекул антигена, связавшихся с поверхностью макрофагов во время инкубации при 4°С, полностью подавлялась трипсинизацией макрофагов сразу после инкубации.

Клетки перитонеального экссудата инкубировали с очищенным белковым производным туберкулина (100  
мкг/мл) в течение 30 мин при 4°С, отмывали и трипсинизиро- вали сразу или через указанное время культивирования при 37°С.

Клетки перитонеального экссудата инкубировали с очищенным белковым производным туберкулина (100 мкг/мл) в течение 30 мин при 4°С, отмывали и трипсинизировали сразу или через указанное время культивирования при 37°С. Заштрихованная площадь соответствует Т-клеточной активации, индуцированной инкубированными с антигеном макрофагами, не подвергавшимися обработке трипсином. Эти данные показывают, что чувствительность к трипсину макрофагов, инкубированных с антигеном при 4°С, быстро теряется при 37°С.

Этот результат показывает, что после инкубации при 4°С молекулы антигена экспонированы на поверхности макрофагов. Второй этап захвата антигена макрофагами зависел от температуры и включал поглощение макрофагами молекул антигена, связанных с их поверхностью. Подавление окислительного и гликолитического метаболизма с помощью азида ж 2-дезоксиглюкозы угнетало накопление иммуногенной активности макрофагами, инкубированными при 37°С.

Действие метаболических ингибиторов на поглощение макрофагами иммунологически активного антигена

Добавки к антигену Включение знтимидина, имп/мин
Культуральная среда
Азид натрия (1 мг/мл)
2-дезоксиглюкоза 20 мм
Азид натрия + 2-дезоксиглюкоза
Цитохалазин В 10 мкг/мл
25 200
23 900
23 900
11 600
21 200

Цитохалазин В, агент, блокирующий макро(но не микро)пинодитоз, не влиял на поглощение антигена. Таким образом, выраженная способность макрофагов приобретать иммуногенный потенциал при 37°С связана с механизмом поглощения антигена требующим затрат метаболической энергии. Поглощение антигена макрофагами, инкубированными с антигеном при 4°С, не зависело от активных метаболических процессов и, по-видимому, заключалось в связывании антигена с поверхностью клетки.

Параллельно с экспериментами, в которых определялась функциональная активность макрофагов, проводились биохимические исследования. Они показали, что используемый в большинстве работ такого рода антиген, 1251-динитро-фенилальбумин морской свинки (ДНФ-АМС), быстро разрушался в макрофагах, но, как и в случае с гемоцианином, 20% антигена оставались связанными с клетками в течение трех дней культивирования. Небольшое количество белка секретировалось в культуральную среду, а часть связанного с клетками белка находилась на клеточной поверхности и могла быть удалена обработкой трипсином. В то же время между этими работами и теми, которые были описаны выше, выявились существенные различия, касающиеся функциональных эффектов обработки инкубированных с антигеном макрофагов трипсином и антителами к ДНФ-АМС. Хотя обработка макрофагов, инкубированных с ДНФ-АМС, трипсином и удаляла поверхностные молекулы настолько, что антитела к ДНФ-АМС переставали связываться с клетками, иммуногенность макрофагов при этом сохранялась даже через 24 и 48 ч после инкубации с антигеном. Трипсинизация влияла на иммуногенность лишь в том случае, если ее проводили сразу после инкубации с антигеном при 4°С, т. е. в тот момент, когда большая часть молекул антигена оставалась на клеточной поверхности. Из этих результатов был сделан вывод, что для зависимого от макрофагов распознавания антигена Т-клетками основное значение имеет трипсин-резистентный компонент ассоциированного с макрофагами антигена, вероятно находящийся внутри клеток. Поскольку антитела к антигену также не влияли на способность инкубированных с ним макрофагов активировать примированные Т-клетки, сделали вывод, что антиген должен находиться в месте, не доступном также и для антител.

Неспособность антител к антигену подавлять пролиферацию Т-лимфоцитов

Добавки к культуре Макрофаги, инкубированные с
- ДНФ-АМС ОБПТ
Эксперимент 1      
Среда
Анти-ДНФ-АМС
1390
1290
164 550
131 530
102 230
  96 890
Эксперимент 2      
Среда
Анти-ДНФ-АМС
1520
4520
147 710
123 620
54 270
48 740

В интерпретации этих результатов имеется одна трудность: макрофаги разрушают большую часть эндоцитированного антигена, используя обычный лизосомный механизм. В любой работе, где делается попытка определить зависимость иммуногенной активности от количества поглощенного макрофагами антигена, необходимо учитывать процесс постепенной деградации антигена наряду с возможно важным в иммунологическом отношении процессингом антигена. Недоступность для трипсина существенных для активации Т-клеток молекул антигена хотя и свидетельствует в пользу того, что антиген поглощается клетками, но все же не доказывает этого строго. Конечно, поглощение молекул антигена путем пиноцитоза — наиболее вероятная гипотеза, но возможно, что связанные с мембраной молекулы антигена в ходе какого-то энергозависимого процесса скапливаются в складках клеточной поверхности и становятся нечувствительными к трипсинизации. Возможно также, что антиген на самом деле находится на клеточной поверхности и чувствителен к трипсину, однако его удаление с поверхности макрофагов при трипсинизации сопровождается постепенным выходом новых молекул антигена из цитоплазмы на поверхность, происходящим за то длительное время инкубации, которое необходимо для оценки активации Т-клеток. Хотя результаты многих работ показывали, что эта возможность маловероятна, в последнее время появились данные, подтверждающие ее.

Другой подход к биохимическому анализу процессинга антигена заключается в сравнении двух сходных клеточных популяций, одна из которых способна презентировать антиген, а другая лишена этой способности. Как указывалось ранее, клетки некоторых В-лимфом могут презентировать антиген, в то время как нормальные В-лимфоциты относительно неэффективны в качестве антиген-презентирующих клеток. Однако когда нормальные В-клетки активировали поликлональным В-клеточным митогеном, липополисахаридом, то образующиеся через три дня после стимуляции В-лимфобласты презентировали антиген так же эффективно, как и В-лимфомы.

Сравнение В-клеток и стимулированных ЛПС В-лимфоцитов по способности презентировать KLH Т-клеткамих

Источник Т-клеток Число вспомогательных клеток к культуре (Х10-3) Синтез ИЛ-2 Т-клетками (ед. ИЛ-2)
нормальные В-клетки ЛПС-бласты
Т-клетки, примированные KLH



Т-клеточная гибридома, специфичная к KLH




100
50
10
5
1
50
10
5
1
0,5
0,1
0
0
0
0
0
80
0
0
0
0
0
80
40
40
10
0
320
160
80
40
20
10

Этот результат показывает, что способность В-клеток функционировать в качестве антиген-презентирующих клеток определяется стадией их дифференцировки и что трехдневные индуцированные ЛПС лимфобласты и В-клеточные лимфомы находятся как раз на соответствующей стадии созревания.

Сравнение нормальных В-лимфоцитов с В-лимфобластами и В-лимфомами показало, что, хотя В-клетки могут сорбировать антиген на своей поверхности и осуществлять жидкофазный пиноцитоз, активность этих процессов у них гораздо ниже, чем у В-лимфобластов и клеток В-лимфом. Так, способность связывать KLH у них была в 10 раз ниже, чем у В-лимфом. Опишем подробно один из экспериментов, показавших, что неспособность В-лимфоцитов представлять антиген вызвана недостаточным его связыванием. В этом эксперименте определяли, могут ли покоящиеся В-лимфоциты представлять кроличьи антитела к мышиным Ig Т-клеткам мыши, примированным нормальным кроличьим гамма-глобулином. Предполагалось, что кроличьи антитела к мышиным Ig, связываясь с поверхностными Ig, должны эффективно захватываться нормальными В-клетками. Действительно, нормальные В-лимфоциты эффективно презентировали антиген при обработке их кроличьим антимышиным Ig, но совершенно не презентировали нормальные гамма-глобулины кролика. Хотя этот результат хорошо согласуется с предположением о недостаточно эффективном поглощении антигена нормальными В-лимфоцитами, возможно и другое объяснение. Оно заключается в том, что кроличьи антитела к мышиным Ig активировали покоившиеся В-клетки, в результате чего они дифференцировались и достигали той стадии созревания, при которой начинается выделение лимфокина, например ИЛ-1, необходимого для активации Т-клеток, или же появляется возможность выполнять такие функции, которые не могут осуществляться покоящимися В-клетками. Так, В-лимфомы и В-лимфобласты могут осуществлять некие важные этапы процессинга антигена, на что покоящиеся В-клетки не способны. Другая возможность состоит в том, что на мембране активированных В-клеток имеются некие структуры, необходимые для эффективного взаимодействия В- и Т-клеток, которые отсутствуют у покоящихся В-клеток.